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采用試劑盒因子法體外培養(yǎng)NK細(xì)胞的方法

發(fā)布日期: 2020-09-27
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Nk細(xì)胞又稱自然殺傷細(xì)胞,是人體內(nèi)抗癌活性免疫細(xì)胞之一,它在骨髓中發(fā)育成熟后,主要存在于外周血、肝臟、腹膜腔和胎盤中,在遇到腫瘤病變細(xì)胞時(shí)就會(huì)把它們殺死,同時(shí)也會(huì)刺激身體產(chǎn)生抗腫瘤的免疫反應(yīng),所以被醫(yī)學(xué)界稱為“抗癌的第1道防線”。

NK細(xì)胞主要分布于外周血,占外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)的5-10%,無需抗原提呈細(xì)胞作為中介提呈抗原,也無需抗體幫助,可直接清除衰老細(xì)胞、變性細(xì)胞、癌細(xì)胞及病毒感染細(xì)胞等。

NK細(xì)胞屬于白細(xì)胞的一種,它是人體忠誠的衛(wèi)士,主要任務(wù)就是消滅那些已經(jīng)被病毒感染的細(xì)胞,從而把病毒消滅在“搖籃”中。另外,身體里面的腫瘤細(xì)胞也是它們追殺的對(duì)象。

NK細(xì)胞在機(jī)體免疫監(jiān)視和早期抗感染免疫過程中起到非常重要的作用,是一種有效、安全的腫瘤生物免疫治療方法,具有廣闊的應(yīng)用前景。

分離培養(yǎng)NK細(xì)胞有多種方法,以下是采用某種試劑盒的因子法體外培養(yǎng)方法來培養(yǎng)NK細(xì)胞:

這種方法采用自體外周血細(xì)胞中分離得到的單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)體外操作使NK細(xì)胞擴(kuò)增活化,通過激活體 內(nèi)特異性免疫反應(yīng)達(dá)到殺火腫瘤細(xì)胞目的的一種體細(xì)胞治療方法。

1.NK細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒包含:
①無血清培養(yǎng)基2瓶(l000mL/瓶):
②NK試劑A, 1支:
③NK試劑B, 1支:
④NK試劑C, 1支:
⑤NK試劑D, 1支:
⑥NK試劑E, 1支:
培養(yǎng)體系中需用到2支(100萬IU/支)rH IL-2
2.原材料
1.采取外周血(可從臍血、骨髓等組織)
2.需的試劑耗材包括:
0.4%苔盼藍(lán)溶液、生理鹽水、人淋巴細(xì)胞分離液(建議選用GE)、175cm²培養(yǎng)瓶、GT-T610 (A)培養(yǎng)袋、15ral/50ml/250ml離心管、移液管、1毫升無菌注射器
3.NK細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間過程:
前一天:要提前處理好細(xì)胞活化瓶(NK試劑A)
第1天:進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞分離與誘導(dǎo)(NK試劑B)
第3天:NK細(xì)胞第1次補(bǔ)液,補(bǔ)液50ml(NK試劑C)
第5天:NK細(xì)胞第二次補(bǔ)液,補(bǔ)液175ml (NK試劑D)
第7天:NK細(xì)胞第三次補(bǔ)液,裝袋并補(bǔ)液500ml (NK試劑E)
第9-10天:NK細(xì)胞第四次補(bǔ)液,分袋并補(bǔ)液750ml
第12天:NK細(xì)胞第五次補(bǔ)液.補(bǔ)液500ml
第13天:檢菌
第14、15天:培養(yǎng)成功
(細(xì)胞培養(yǎng)成功時(shí)間視具體細(xì)胞生長情況而定,在保持培培養(yǎng)基ph和細(xì)胞活力正常的情況下也可以多培養(yǎng)一天)
4.具體操作步驟如下:
1.頭一天一定要先處理細(xì)胞活化瓶。
2.將NK試劑A (4度保存)加入到含有12.5ml生理鹽水的175cm²底面積細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,充分的混勻 30秒-1分鐘,使液體充分在瓶底分散,4度冰箱平放過夜
(NK試劑A需要和生理鹽水充分混勻平鋪在瓶底;次日取出后直接吸棄液體即可,無需清洗)
3.外周血單個(gè)核細(xì)胞分離與誘導(dǎo)(第1天)
4.以100ml外周血為例,如血量不同,也可按操作規(guī)程做相應(yīng)調(diào)整。
5.將患者外周血,用移液訝吸取少許原血(約300 ul)劃線或滴入平皿過行檢菌。然后,正常室溫下,進(jìn)行離心。
6.將上層血漿轉(zhuǎn)入離心,滅活,離心,取上清液備用。
7.使用等體積的生理鹽水與血細(xì)胞沉淀混勻后,小心加到Ficoll層上,使分層保持清晰。室溫內(nèi)進(jìn)行離心。
8.吸取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)層,盡量吸盡兩液面交接處的細(xì)胞層.加生理鹽水吹打混勻,離 心。相同方法冉次洗滌細(xì)胞。
9.棄去上清后,用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,吸取少量細(xì)胞計(jì)數(shù)。
10.按照細(xì)胞密度為1-2*10^6個(gè)/ml(5 *10^6個(gè)/ml),用培養(yǎng)基清洗離心管,并入培養(yǎng)瓶內(nèi),并加入1支NK試劑B,患者滅活血漿1.25ml (5%)確保培養(yǎng)基終體積為25ml左右。剩余血漿4°C 密封保存?zhèn)溆谩?br />    注:包被瓶取出時(shí)間為細(xì)胞加入前5分鐘,其他時(shí)間需在4度放置備用。
    試劑A、B、C、D、E的取用.違議第1次吸取原液后.以適貴培養(yǎng)基沖洗西林瓶后再吸出,以大程度減少損耗

11.活化培養(yǎng)基的配置:其中1瓶無血清培養(yǎng)基中,加入100萬IU的IL-2,終濃度為1000IU/mL。
      注:活化培養(yǎng)基每次使用前恢復(fù)至室溫。
12.NK細(xì)胞的第1補(bǔ)液(第3天),補(bǔ)加含有5%的患者滅活血漿和NK試劑C,確保培養(yǎng)的終體積為 75mL。
13.NK細(xì)胞的第二次補(bǔ)液(第5天),補(bǔ)加含有5%的患者滅活血漿和NK試劑D,確保培養(yǎng)的終體積為 250ml.
14.NK細(xì)胞的第三次補(bǔ)液及其裝袋(第7天),細(xì)胞轉(zhuǎn)袋前將培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞進(jìn)行輕微吹散細(xì)胞,隨后將培養(yǎng)瓶的中的細(xì)胞懸液及其500mL活化培養(yǎng)基,裝入到細(xì)胞培養(yǎng)袋中,同時(shí)加入1支NK試劑E,及其剩余的全部血漿,確保終體積為750ml。
15.NK細(xì)胞的第四次補(bǔ)液(第9天),主要為分袋操作,將培養(yǎng)體系由750ml擴(kuò)增至1500ml。
16.NK細(xì)胞的第五次補(bǔ)液(第!2天).主要為補(bǔ)液操作,將剩余的500mL擴(kuò)增液均分到2個(gè)培養(yǎng)袋中,確保每袋體積為1000ml。
17.檢菌,細(xì)胞培養(yǎng)第13天,對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行檢菌、內(nèi)毒素檢測。用5ml注射器分別從培養(yǎng)瓶和袋內(nèi)抽取少細(xì)胞懸液,加入正置的平皿中,放入35℃恒溫生化培養(yǎng)箱, 記錄放入日期及培養(yǎng)物品。隔夜后倒置,保留48小時(shí)。
18.收獲,正常情況下,第13, 14天各收獲1000ml細(xì)胞懸液。若因臨床需要進(jìn)行提前或延遲回輸,也可相應(yīng)提前或延遲。(NK細(xì)胞建議2-4h之內(nèi)使用,以保證其活性)

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